حاسبة الربط

الفئة: علم الأحياء
- سبتمبر 03, 2025
| |

DNA المتجه

DNA الإدخال

إعداد تفاعل الربط

الكمية الموصى بها من الإدخال
8.3 ng
0.33 μL من مخزون الإدخال
كمية المتجه
50 ng
باستخدام 1 μL من مخزون المتجه
نسبة الإدخال:المتجه
3:1 (مولاري)
مثالي للت cloning القياسي

إعداد التفاعل الكامل

المكون الحجم (μL) الكمية النهائية
DNA المتجه (50 ng/μL) 1.0 50 ng
DNA الإدخال (25 ng/μL) 0.33 8.3 ng
10× T4 DNA ليغاز Buffer 2.0 1×
T4 DNA ليغاز 1.0 400 U
ماء خالي من النوكلياز 15.67 إلى 20 μL
إجمالي الحجم 20.0

نصائح التحسين

استنادًا إلى معلمات الإدخال الخاصة بك، إليك بعض التوصيات:

  • للنهايات اللزجة 5' مع نسبة المتجه:الإدخال 1:3، قم بالحضانة عند 16°C لمدة 4 ساعات.
  • ستساعد معالجة CIP للمتجه في تقليل خلفية الربط الذاتي.
  • إذا كانت كفاءة التحويل منخفضة، حاول زيادة نسبة الإدخال:المتجه إلى 5:1.
  • لعمليات الربط ذات النهايات المستقيمة، قم بزيادة تركيز الليغاز ومدد وقت الربط.
  • قم بتعطيل الليغاز بالحرارة عند 65°C لمدة 10 دقائق قبل التحويل للحصول على أفضل النتائج.

حول ربط DNA

  • يتضمن ربط DNA انضمام قطع DNA من خلال تشكيل روابط فوسفاتيديل.
  • يتطلب T4 DNA ليغاز ATP وMg²⁺ للعمل بشكل صحيح (مقدمة في محلول الربط).
  • تكون عمليات الربط ذات النهايات اللزجة أكثر كفاءة من عمليات الربط ذات النهايات المستقيمة.
  • تتراوح نسب المولارية للمتجه:الإدخال عادة من 1:3 إلى 1:5 للت cloning القياسي.
  • توصى نسب الإدخال:المتجه الأعلى (3:1 إلى 10:1) لعمليات الربط ذات النهايات المستقيمة أو الإدخالات الأكبر.
  • تمنع إزالة الفوسفات من المتجهات (باستخدام CIP، SAP، إلخ) الربط الذاتي للمتجه.
  • يمكن أن تقلل أنظمة الليغاز السريعة من وقت الربط إلى 5-15 دقيقة عند درجة حرارة الغرفة.

معادلة كمية الإدخال (نانوغرام):

\[ \text{إدخال نانوغرام} = \left( \frac{\text{نانوغرام المتجه} \times \text{حجم الإدخال بالكيلوبايت}}{\text{حجم المتجه بالكيلوبايت}} \right) \times \left( \frac{\text{مولات الإدخال}}{\text{مولات المتجه}} \right) \]

ما هو حاسبة الربط؟

حاسبة الربط هي أداة تساعد الباحثين في تحديد الكمية المناسبة من الحمض النووي المتجه والإدخال المطلوبة لنجاح تفاعل الربط. يعتبر ربط الحمض النووي خطوة حاسمة في الاستنساخ الجزيئي، حيث يتم دمج إدخال الحمض النووي مع متجه بلازميد باستخدام إنزيم يسمى DNA ligase.

كيف تعمل؟

تسمح هذه الحاسبة للمستخدمين بإدخال تفاصيل حول المتجه والإدخال، بما في ذلك الطول والتركيز. بناءً على النسبة المولية المختارة، تحسب الكمية المطلوبة من الحمض النووي للإدخال لتحقيق تفاعل ربط مثالي.

الميزات الرئيسية

  • تحسب النسب المولية بين المتجه والإدخال لسيناريوهات استنساخ مختلفة.
  • تدعم كل من النسب المولية القياسية والمخصصة.
  • تقدم توصيات لظروف الربط بناءً على الاستنساخ ذو الأطراف اللاصقة أو المستقيمة.
  • تتضمن نصائح تحسين لزيادة كفاءة الربط.

كيفية استخدام الحاسبة

  1. أدخل طول المتجه (bp) والتركيز (نانوغرام/ميكرولتر).
  2. أدخل طول الإدخال (bp) والتركيز (نانوغرام/ميكرولتر).
  3. اختر النسبة المولية المطلوبة بين المتجه والإدخال (مثل 1:3، 1:5).
  4. حدد حجم التفاعل الكلي (مثل 20 ميكرولتر).
  5. لإعدادات متقدمة، اختر درجة حرارة الربط، والمدة، ونوع الليغاز، وخيارات معالجة المتجه.
  6. انقر على "احسب" للحصول على كمية الإدخال الموصى بها وإعداد التفاعل.

الأسئلة الشائعة

ما هي النسبة المولية المثلى بين المتجه والإدخال؟

لعمليات الربط ذات الأطراف اللاصقة، يُوصى عمومًا بنسبة 1:3 أو 1:5 بين المتجه والإدخال. بالنسبة لعمليات الربط ذات الأطراف المستقيمة، قد تحسن النسبة الأعلى (مثل 1:5 إلى 1:10) الكفاءة.

لماذا يُوصى بإزالة الفوسفات من المتجه؟

تمنع إزالة الفوسفات (باستخدام CIP، SAP، أو الفوسفاتاز القطبي) الربط الذاتي للمتجه، مما يقلل من المستعمرات الخلفية غير المرغوب فيها.

ما هي ظروف الربط التي يجب أن أستخدمها؟

  • 16 درجة مئوية لمدة 4 ساعات – شرط قياسي لليغاز T4 DNA.
  • درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة – مناسبة لليغاز السريع.
  • طوال الليل عند 16 درجة مئوية – موصى بها لعمليات الربط الصعبة أو الاستنساخ ذو الأطراف المستقيمة.

كيف يمكنني تحسين كفاءة الربط؟

  • تأكد من النسبة المولية الصحيحة للمتجه والإدخال.
  • استخدم ليغاز الحمض النووي الطازج والمحلول.
  • قم بتحسين ظروف الربط (درجة الحرارة والمدة).
  • تأكد من وجود الإدخال عبر الرحلان الكهربائي للهلام قبل الربط.

لماذا استخدام هذه الحاسبة؟

تسهل حاسبة الربط إعداد تفاعلات ربط الحمض النووي، مما يساعد الباحثين في تحديد الكميات الصحيحة من المتجه والإدخال لاستنساخ فعال. من خلال أتمتة الحسابات وتقديم نصائح التحسين، توفر الوقت وتزيد من معدل نجاح تجارب الربط.